Иммунитет у больных перитонитом

3-я часть            4-я часть            3 глава 4-й части

Содержание монографии

 

Часть 4. Метаболическая иммунокоррекция в лечении больных распространенным перитонитом (со­вме­ст­но с Г.В. Бу­лы­ги­ным)

 

ГЛАВА 1. Иммунитет у больных перитонитом

(обзор литературы)

 

Содержание 1-й главы 4-й части:

ГЛАВА 1. Иммунитет у больных перитонитом

1.1. Общие вопросы патогенеза перитонита

1.2. Роль иммунной системы и нейро-иммунно-эндокринной регуляции в патогенезе перитонита

1.3. Взаимосвязь функциональных возможностей иммунокомпетентных клеток и их структурно-метаболических характеристик

1.4. Принципы лечения перитонитов

1.5. Методы индивидуального подбора иммунокорригирующих препаратов

1.6. Заключение

Глава 2. Материал и методы исследования

2.1. Материал исследования

2.2. Методы исследования

 

1.1. Общие вопросы патогенеза перитонита

Совершенствование и усложнение технологий лечения хирургических больных, к сожалению, не может полностью исключить риск развития послеоперационных осложнений, в том числе, перитонита, летальность при котором вследствие несостоятельности анастомозов и стрессовых перфораций кишечника составляет до 78% [72]. Перитонит и в настоящее время остается одной из основных проблемных патологий ургентной и интенсивной терапии [25]. Общая летальность при этом заболевании колеблется в пределах 18-20%, возрастая при его распространенных формах до 30-40% [32]. Даже после устранения или отграничения источника инфицирования, санации поверхности брюшины и активного дренирования брюшной полости, метаболической и массивной антибактериальной терапии у каждого второго больного в различные сроки послеоперационного периода развиваются некорригируемый инфекционно-токсический шок и выраженная полиорганная недостаточность (ПОН), при которых летальность достигает 60-80% [85, 297].

 

Несмотря на большие успехи в области антимикробной химиотерапии, часто ее применение не может определять успешность лечения больных перитонитом и трудности лечения связаны с особенностями микроорганизмов-возбудителей, нередко при гнойной хирургической инфекции (ГХИ) обладающих резистентностью ко многим антибактериальным препаратам [144]. На протяжении последних лет в структуре возбудителей перитонитов анаэробная флора встречается, в среднем, в 13%, аэробная флора – в 11%, микст-культуры – в 76%. Среди аэробов доминируют Escherichia coli и Streptococcus species. Анаэробные микроорганизмы представлены, в основном, Bacteroides, Peptostreptococcus и Clostridium species [166].

 

Однако, по мнению некоторых исследований, видовой состав и чувствительность микроорганизмов к антибиотикам не определяют исход заболевания и вероятность развития осложнений [230]. Выздоровление при этих состояниях зависит не исключительно от свойств возбудителей инфекциии, а от характера и выраженности органной патологии, особенностей иммунной системы больного и других факторов [5, 278].

При лечении пациентов с перитонитом не может быть достаточным использование препаратов, действующих только на инфекционный агент и воспалительный процесс. Гарантией выздоровления может быть только восстановление адекватного иммунного ответа организма на микробную агрессию.

 

Вверх                     Содержание монографии 

 

1.2. Роль иммунной системы и нейро-иммунно-эндокринной регуляции в патогенезе перитонита

Хирургическая операция вызывает снижение функций всех основных звеньев иммунной системы: гуморального и клеточного иммунитета, фагоцитоза [281], так как сами по себе операционная травма и боль вызывают иммуносупрессию [244].

 

Наблюдаемое в послеоперационном периоде снижение показателей клеточного и гуморального звеньев иммунитета у большинства больных клинически могут не проявляться [222]. Однако послеоперационная иммуносупрессия сопровождается высокой частотой инфекционных осложнений [160] и рассматривается как одна из основных причин их развития [56]. Необходимое наложение лапаростомы также может стать причиной постоперационной иммуносупрессии [319]. Возникающие иммунологические нарушения могут усугублять проявления синдромов тканевой гипоксии и нарушений микроциркуляции в период развития гнойно-септических осложнений у хирургических больных [72].

 

Регистрируемые при перитонитах изменения лейкограммы выражаются в увеличении относительного содержания палочкоядерных и появлении юных нейтрофилов и миелоцитов, исчезновении из кровотока эозинофилов. Перитонит сопровождается снижением абсолютного количества лимфоцитов и их митогенного ответа [221]. Одним из механизмов лимфопении при перитоните может быть апоптоз активированных Т-лимфоцитов под действием гормонов стресса [212]. Функциональное состояние Т-звена иммунной системы способно отражать тяжесть перитонита и его распространенность [61], а глубокая Т-лимфопения при перитонитах может служить неблагоприятным прогностическим признаком его течения [41, 57].

 

Гнойное воспаление брюшной полости, многокомпонентный наркоз, хирургическая травма, массивная антибактериальная терапия, с точки зрения ряда исследователей, неизбежно приводят к иммунологическим поломкам [81, 261], а длительная антигенная стимуляция снижает эффективность клеточного ответа [321], поэтому развитие послеоперационного перитонита некоторые авторы связывают со снижением иммунорегуляторного индекса – CD4/CD8 [288]. Характерные для перитонита Т-лимфопения с дисбалансом иммунорегуляторных субпопуляций проявляются снижением иммунорегуляторного индекса (CD4/CD8) и наиболее выражены на высоте интоксикации, затем, параллельно с улучшением состояния больного на фоне проводимого комплексного лечения, степень Т-иммунодефицита уменьшается. Иммунорегуляторный индекс в случае благоприятного течения болезни повышается, достигая у реконвалесцентов нормальных значений [53]. Терминальная стадия перитонита характеризуется несоответствием клиники и иммунного статуса при декомпенсации защитных механизмов [57]. У пациентов с летальным перитонитом обнаружены нарушения пролиферации Т-лимфоцитов и продукции цитокинов [295].

 

В результате ранее проведенных исследований не найдено изменения числа В-лимфоцитов в периферической крови после оперативных вмешательств [314]. Однако обнаружены нарушения реакции бласттрансформации лимфоцитов в ответ на стимуляцию митогенами в течение 7-9 дней послеоперационного периода [279]. При перитонитах снижается продукция антител к возбудителям бактериальных инфекций [211]. У больных, находящихся на пролонгированном перитонеальном диализе, уменьшение концентрации сывороточных иммуноглобулинов повышает риск развития перитонита [288], который снижается при внутриполостном введении иммуноглобулинов [245]. Состояние местных механизмов защиты брюшины при перитоните также определяется клетками лимфоидной ткани [215]. В реализации и координации защитных функций брюшины Т-лимфоциты, наряду с макрофагами, играют очень важную роль [304].

 

При перитоните наблюдаются выраженные изменения в регионарных лимфоузлах, которые отражают повышение функционирования клеток, ответственных за выработку гуморальных факторов иммунной защиты [300]. Нарушения гуморального иммунитета включают не только изменения функций В-лимфоцитов, но и нарушения в системе комплемента [316].

 

В послеоперационном периоде наблюдается напряженность работы психонейроэндокринной и иммунной систем [315], функциональное единство которых признается многими авторами [2, 3, 132, 141, 227].

Установлено наличие общих перекрестно реагирующих антигенов в мозге и вилочковой железе, большого количества медиаторов иммунной системы, которые активны в подкорковых образованиях ЦНС [2]. Лимфоциты способны синтезировать эндорфины, выделяемые при симпатических влияниях [234] и ацетилхолин, обладающий иммунотропным эффектом [155, 203, 228, 235, 305, 307], а также факторы, стимулирующие выброс катехоламинов клетками мозгового вещества надпочечников [302]. Холинергические стимулы модулируют состояние лимфоцитов и клеток различных областей мозга, [289, 182] изменяют экспрессию поверхностных структур лимфоцитов и влияют на дифференцировку клеток [173].

 

Повышение активности гипоталамических центров приводит к активации как симпато-адреналовой, так и гипофизарно-надпочечниковой систем. Изменения в эндокринной системе после хирургической агрессии включают секрецию гормонов, способствующих катаболизму наряду со снижением секреции или действия анаболических гормонов [236]. Нарушения обменных процессов в целом сводятся к развитию метаболической дисфункции и синдрома гиперметаболизма [75, 277]. Катехоламины и глюкокортикоиды могут непосредственно воздействовать на иммунокомпетентные клетки, вызывая функциональные [131, 213] и структурные нарушения [2, 3, 54]. При ГХИ число рецепторов лимфоцитов к глюкокортикоидам существенно возрастает по сравнению с показателями здоровых индивидов; у пациентов с последующим летальным исходом наблюдается обратная тенденция [158].

 

Нейротрансмиттеры и психотропные средства оказывают воздействие на иммунную и эндокринную системы [254, 272, 286], а экспериментальная депрессия сопровождается как нарушениями нейрорецепции, так и снижением эффективности работы специфического и неспецифического звеньев иммунитета [238].

 

В процессах формирования иммунного ответа существенная роль принадлежит ГАМК – основному тормозному нейромедиатору [184]. Бензодиазепины, блокируя рецепторы ГАМК, оказывают угнетающий эффект как на нервную, так и на иммунную системы [265]. Агонисты ГАМК-ергических рецепторов, напротив, усиливают иммунный ответ [224], что проявляется активацией иммунной системы и числа Т-лимфоцитов [184].

Наличие общих регуляторных механизмов и медиаторов иммунной и центральной нервной систем в значительной мере определяет связь стрессовых реакций и иммунной недостаточности [121, 310]. Поэтому применение для коррекции иммунного статуса препаратов, влияющих на функции ЦНС, по мнению некоторых авторов, является вполне оправданным [2, 72].

 

Вверх                     Содержание монографии 

 

1.3. Взаимосвязь функциональных возможностей иммунокомпетентных клеток и их структурно-метаболических характеристик

Физиологические возможности ИКК тесно связаны с их метаболическим статусом. Выполнение лимфоцитом специфических функций требует определенного состояния внутриклеточных биохимических процессов, поддерживаемого оптимальной активностью внутриклеточных ферментов [30, 91]. Поиск связей этих характеристик долгое время является предметом пристального изучения [14, 26, 133, 138].

 

С функциональной точки зрения, клеточные мембраны можно представить как сложноорганизованные системы, которые, во-первых, контролируют внутриклеточный гомеостаз, а во-вторых, опосредуют его изменения в ответ на внешние воздействия [79, 80, 134]. Послеоперационная иммуносупрессия, в том числе при перитоните, ассоциирована с нарушением экспрессии рецепторов на поверхности иммунокомпетентных клеток [157, 161, 223].

 

Формирование иммунного ответа и экспрессия антигенов главного комплекса гистосовместимости на мембранах ИКК зависит от веществ липидной природы [172]. Состав липидных фракций мембран изменяется, например, при адаптационных реакциях [15, 17], гнойной хирургической инфекции [5, 14]. Повышение вязкости мембран приводит к снижению активности клеточных рецепторов клеток [137].

 

Жирные кислоты – не только субстраты липидного обмена, но и необходимый компонент клеточных мембран, транспортных и рецепторных комплексов [16, 59, 151]. Изменения их баланса могут приводить к нарушению основ функционирования клетки [189] и встречаются при критических состояниях [129, 168].

 

Различные жирные кислоты – иммунологически активные вещества [180]. Один из представителей ЖК - арахидоновая кислота – предшественник многих физиологических иммуномодуляторов. Все ее производные являются продуктами активированных клеток. Усиление метаболизма арахидоновой кислоты – основной внутриклеточный эффект кортикостероидов [243, 301]. Высвобождение арахидоновой кислоты активирует механизмы защиты лимфоцитов от перекисного окисления [216]. В клетках существуют и другие механизмы блокирования процессов ПОЛ за счет синтеза избирательных ингибиторов оксигеназ, в том числе, веществ жирнокислотной природы [228]. В то же время глюкокортикоиды, с участием тканевого посредника липомодуллина, могут тормозить активность фосфолипазы-А2 и освобождение арахидоновой кислоты из клеточных мембран [243]. Как циклооксигеназный, так и липооксигеназный пути метаболизма арахидоновой кислоты приводят к высвобождению иммунологически активных соединений.

 

Полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) влияют на физическую структуру мембран, их рецепторный аппарат, активность ассоциированных с мембранами ферментов [240] и иммунопролиферативные процессы [233]. Количество ПНЖК зависит от активности генетического аппарата и пролиферативных возможностей клетки [258].

 

Жирные кислоты тесно связаны с внутриклеточными процессами: продукцией ацетил-КоА-синтетазы [178] и активностью ЛДГ [250]. Метаболизм глюкозы, глютамина, пирувата в клетке зависит от содержания жирных кислот и эйкозаноидов [268]. Пальмитиновая и олеиновая жирные кислоты в эксперименте влияют на работу митохондрий [4]. Жирные кислоты модулируют не только метаболизм глюкозы и липидов, но и других субстратов, оказывающих влияние на иммунную систему [187, 210, 220, 239, 249]. Также обсуждается вопрос о возможности модуляции жирными кислотами чувствительности клеток к стероидным гормонам, регуляции синаптических взаимодействий [273, 325], в том числе с участием ГАМК, [255, 328] и передачи болевых импульсов [287]. Эффекты регуляторных влияний парасимпатического отдела ВНС также реализуются с участием жирных кислот [274].

 

Эйкозаноиды - группа химических соединений, продуктов полиненасыщенных жирных кислот с С₁₈-, С₂₀-, С₂₂-углеродными скелетами. Эйкозаноиды принимают участие в развитии иммуносупрессии, индуцированной травмой, активируют генетический аппарат [260], и синтез de novциклооксигеназы [197, 284], стимулируют пролиферацию лимфоцитов [207, 251, 296].

 

Приведенные выше факты позволяют с уверенностью утверждать, что состояние ИКК и их функциональные резервы в норме и патологии определяются биохимическим составом клеточных структур, влияющим на активность протекающих в них метаболических процессов. Описаны изменение активности лизосомальных ферментов при сепсисе [241], ферментов ПФП при резистентном к химиотерапии лейкозе [271]. Внутриклеточные ферменты ИКК изменяют свою активность при вирусных гепатитах [47], заболеваниях ЛОР-органов [34], аутоиммунной патологии [143], заболеваниях легких [27, 65], токсоплазмозе [306]. Экспериментальный иммунодефицит у животных приводит к снижению активности митохондриальных форм липидзависимых шунтов: малик-фермента, глицерол-3-фосфатдегидрогеназы [145].

 

Некоторые первичные иммунодефицитные состояния (ИДС) в своей основе имеют ферментопатии [105, 109], приводящие к нарушениям функций клеточного [246] и гуморального звеньев иммунной системы [20, 29]. Установлено, что нарушение бактерицидной функции фагоцитов отражает врожденную патологию гексозо-монофосфатного шунта, при которой блокируется наработка кислородзависимых бактерицидных факторов [79, 80].

 

Вторичные ИДС также рассматриваются с позиций нарушения процессов внутриклеточного обмена [16, 29, 53]. Существуют работы, освещающие данную проблему при ГХИ [14, 52]. Авторами показаны отличия структурно-метаболических показателей лимфоцитов при локализованной и генерализованной формах гнойной хирургической инфекции. Согласно приведенным результатам, генерализация ГХИ обусловлена исходным метаболическим статусом иммунокомпетентных клеток пациентов, динамика показателей которого определяет исход заболевания [5, 14, 26].

 

Поломки на уровне мембранных структур клетки приводят к нарушению функционирования ассоциированных с ними ферментных систем [23, 135], что в конечном итоге может вызывать нарушение процессов формирования иммунного ответа [77, 104].

 

К сожалению, исследования показателей липидного обмена ИКК и активность внутриклеточных ферментов при ГХИ немногочисленны [26, 52, 53, 108, 159, 201], а биологическая роль внутриклеточных жирных кислот, способных отражать потенциальные возможности к пролиферации и эффекторной активности ИКК, при перитоните практически не изучена.

 

Вверх                     Содержание монографии 

 

1.4. Принципы лечения перитонитов

Обязательным условием лечения перитонита являются хирургическая санация брюшной полости и метастатических гнойных очагов (при развитии сепсиса) с наиболее полным удалением некротических масс, способствующих сохранению патологического процесса, а также адекватное дренирование либо послеоперационный лаваж брюшной полости [25, 219, 266]. При невозможности полноценной однократной санации брюшной полости активная тактика лечения больных перитонитом предусматривает многократные плановые релапаротомии или применение лапаростомии [7, 32, 78, 125]. Последний способ достоверно снижает прогнозируемую летальность по шкале Мангеймского индекса перитонита [186]. Оптимальным сроком для проведения плановых санаций брюшной полости с точки зрения прогноза исхода заболевания считают 48 часов [242].

 

Интенсивная терапия больных перитонитом в послеоперационном периоде обязательно включает: коррекцию реологических нарушений и электролитного состава крови [31, 111, 128, 136, 154, 201]; применение эфферентных методов детоксикации [35, 37, 38]; рациональную антибактериальную терапию [1, 33, 43, 50, 58, 85, 144, 214]; парентеральную нутритивную поддержку с переходом на энтеральное питание [75, 162, 181, 190, 252, 290]; поддержку функций внешнего дыхания и предупреждение тканевой гипоксии [19, 66, 111]; восстановление функции желудочно-кишечного тракта [18, 19, 68, 128]; применение комплекса мероприятий антистрессорной защиты [6, 111].

 

Среди обязательных лечебных мероприятий коррекция состояния иммунной системы имеет существенное значение [10, 21, 51, 52, 55, 82, 214, 237].

 

Исходя из нарушений иммунного статуса, встречающихся при перитонитах, а именно, Т-иммунодефицита и дефектов фагоцитоза, в настоящее время наиболее часто назначаются препараты тимусного происхождения, стимуляторы фагоцитарной активности или их сочетания [51, 52, 82, 136, 156, 176]. Предложены и методы контроля за эффективностью действия иммунотропных препаратов: например, показанием к назначению тималина больным ГХИ некоторые авторы считают отсутствие повышения содержания лейкоцитов в периферической крови, а эффективность лечения оценивают по кратности повышения показателя [100]. Для оценки функционального состояния иммунной системы также определяют фагоцитарную активность лейкоцитов, концентрацию циркулирующих иммунных комплексов и иммуноглобулинов класса G [96]. 

Предложено не только множество способов выбора воздействий на иммунную систему в зависимости от состояния пациента, но разрабатываются и универсальные способы иммуномодуляции. Так, для коррекции любых нарушений функций нейтрофильных гранулоцитов предлагается использование галоперидола [97]. В качестве способа иммунокоррекции при гнойном перитоните предложено внутрикожное введение аутологичной сыворотки крови больного, обработанной зимозаном [94].

 

Наличие метаболических нарушений в ИКК при иммунодефицитах и возможность коррекции вторичных иммунодефицитных состояний препаратами метаболического ряда освещена многими исследователями [5, 29, 52, 53, 70, 294].

 

В арсенале современной медицины имеются высокоэффективные препараты-иммунокорректоры нового поколения для проведения иммунотерапии у больных ГХИ: имунофан, полиоксидоний, реамберин, глутоксим и другие.

 

Имунофан - синтетическое производное гормона тимопоэтина - активирует лимфоидные клетки путем образования в цитоплазме вторичных мессенджеров с последующей генерацией сигнала на разнообразные индукторы [72]. Оказывает выраженное действие только на клетки с резко измененными показателями метаболической и функциональной активности [298]. Способен одновременно оптимизировать адаптационные резервы иммунной и нервной системы, что позволяет корригировать посттравматические стрессовые расстройства [64, 72]. Препарат стимулирует кислород-зависимую систему бактерицидности нейтрофилов и одновременно инактивирует избыток свободно-радикальных соединений, повышает белковосинтетическую и детоксикационную функции печени, стимулирует синтез иммуноглобулинов, повышает ИРИ [72, 73, 74].

 

Полиоксидоний (производное N-окси-поли-1,4-этиленпиперазина) обладает активирующим действием на неспецифическую резистентность организма, фагоцитоз, гуморальный и клеточный иммунитет [49, 107]. Добавление его к вакцинам облегчает формирование иммунитета у детей [90] и лиц с возрастным иммунодефицитом [126]. При применении полиоксидония наблюдается повышение количества лимфоцитов в периферическом кровотоке, концентрации сывороточных иммуноглобулинов, фагоцитарной активности макрофагов и нейтрофилов [9, 48].

 

Реамберин – 1,5% раствор янтарной кислоты, нашел применение при разного рода критических состояниях в качестве антиоксиданта. Янтарная кислота является энергетическим субстратом аэробного окисления [270] и может оказывать непосредственное воздействие на метаболизм ИКК; добавление в среду инкубации янтарной кислоты повышает оксидативные возможности лейкоцитов [323]. Доказан положительный эффект препарата при лечении больных с ПОН на фоне перитонита, снижение тяжести состояния больных по шкале SAPS [116]. Реамберин успешно использовался при лечении гриппа [60], вирусных гепатитов [123, 124], интоксикации при механических желтухах [40], постишемических энцефалопатий [116].

 

Глутоксим – олигопептид, бис-(гамма-L-глутамил)-L-цистенил-бис-глицин динатриевая соль; синтетический аналог глутатиона. Он является представителем нового класса лекарственных средств – тимопоэтинов, обладающих свойствами системных цитопротекторов, иммуномодуляторов и гемопоэтических факторов [63]. Глутоксим оказывает влияние на процессы тиолового обмена, является антиоксидантом [199, 174, 292, 327]. Во многом действие препарата определяется свойствами глутатиона, участвующего в детоксикации ксенобиотиков [69, 130], снижающего интенсивность перекисного окисления липидов [275, 291, 313], в том числе при септических состояниях [309], так как оксидативный стресс сопровождается снижением концентрации глутатиона и повышением содержания в плазме жирных кислот [226] и СО₂ [311, 261]. Биосинтез клетками глутатион-S-трансферазы определяет характер течения генерализованной хирургической инфекции [22]. В связи с тем, что синтез в клетке de novглутатиона энегретически невыгоден [150], применение глутоксима является оправданным при многих критических состояниях, в том числе при перитоните.

 

Иммунокорригирующее действие глутоксима частично можно объяснить свойствами его составляющих, например, глутамина – субстрата пластического и энергетического обмена [257, 259, 267]. При стрессах и обширных оперативных вмешательствах уровень глутаминовой кислоты снижается параллельно количеству Т-хелперов [179, 193, 194, 195, 225, 229] и ацетилхолина [175]. Глутаминовая кислота повышает фагоцитарную активность нейтрофилов, производство активного кислорода, бактериальный киллинг [294], биосинтез интерлейкинов ИКК [171], влияет на активность фосфолипазы С [149] и метаболизм эйкозаноидов [163, 175], способствует экспрессии рецепторов на поверхности ИКК [218]. Глютаминовая кислота - иммуноактивирующий субстрат [170, 185, 196, 209] и иммунопротектор [171]. Ее назначение снижает риск развития послеоперационных осложнений [152, 208, 280].

 

Глицин наряду с ГАМК относится к тормозным нейромедиаторам, его содержание в плазме крови изменяется при патологии нервной системы [149], как и холин, он проявляет термопротективное и осмопротективное действие [320].

 

Цистеин, также входящий в состав глутоксима, повышает иммунологическую резистентность организма [269, 324].

 

Пирацетам - синтетический аналог ГАМК, является метаболитом- предшественником нейротрансмиттеров. При недостаточности собственных путей синтеза образование ГАМК происходит за счет оттока субстратов из ЦТК (шунт Робертса). Взаимная обедненность субстратами этих сопряженных метаболических циклов негативно отражается на функционировании нейроэндокринной системы в целом [62, 102]. Также имеется связь между обменом ГАМК и глютаминовой кислоты [247]. ГАМК-ергическая система функционально ассоциирована с активностью парасимпатического отдела ВНС [142], стимуляция рецепторов ГАМК ограничивает развитие стресс-реакции и предупреждает индуцированную стрессом лимфопению [142]. ГАМК модулирует цитотоксичность и Т-клеточный ответ на митогены иммунокомпетентных клеток [36, 204, 205], что может оправдывать назначение пирацетама с иммунотропными и нейропротективными целями.

 

В основе реакции организма на препараты лежат особенности внутриклеточного метаболизма клеток, определяемые потенциальной активностью их ферментных систем, возможности которых генетически обусловленны [188, 200]. Это подтверждается, например, широкими в норме колебаниями индивидуальной реакции на нейромодуляторы и гормоны [326].

 

Вверх                     Содержание монографии

 

1.5. Методы индивидуального подбора иммунокорригирующих препаратов

Известно, что эффективность применения иммуномодуляторов у больных различна и является индивидуальной [51]. В настоящее время подбор препаратов осуществляется на основе данных иммунного статуса, не всегда точно отражающего состояние иммунной системы, в результате чего отмечается недостаточная клиническая эффективность применения иммунокорригирующих препаратов [114]. Это заставляет искать критерии индивидуального подбора иммунотропных препаратов.

 

Наиболее распространенными способами оценки предполагаемого влияния лекарственных средств на состояние иммунитета больного являются так называемые нагрузочные тесты [71]. Сутью этих методов является оценка изменений различных параметров ИКК после их инкубации in vitrс терапевтической концентрацией препарата и последующее заключение о вероятной иммуномодулирующей эффективности тестируемого препарата при лечении больного. В качестве критериев различными авторами используются реакции розеткообразования, иммунофлуоресценции, фагоцитоза, НСТ, РБТЛ и другие.

 

Одним из вариантов оценки результатов нагрузочных тестов является определение поверхностных структур клеток. Например, для выбора иммунокорректора оценивают модифицирующее действие препаратов на экспрессию комплекса дифференцировочных антигенов СDЗ, CD4, CD8, CD38, HLA 1 [95], антигенблокирующую активность крови [92] или реакцию розеткообразования [46, 93]. В то же время указывается, что при интерпретации результатов подобных нагрузочных тестов необходимо учитывать наличие выраженной зависимости выявления поверхностных маркеров клеток от качества используемых индикаторных частиц, а также чувствительность используемого метода [71].

 

Второй вариант оценки результатов нагрузочных тестов включает в себя определение функциональной активности ИКК. Предложен подбор препаратов по результатам оценки теста с нитросиним тетразолием (НСТ-тест) [99, 101]. Однако методы, имеющие в основе НСТ-тест, расчитаны на определение активности пиноцитоза и отражают функциональное состояние нейтрофилов, отвечающих в большей степени за неспецифический иммунитет. Кроме того, необходимо учитывать и тот факт, что механизмы пино- и фагоцитоза существенно различаются, поэтому использование результатов НСТ-теста для характеристики функционального состояния фагоцитарного звена не вполне корректно.

Функциональную активность ИКК можно оценить по их способности к пролиферации [45, 98]. Но выполнение этих методик требует очень значительных затрат времени, что неприемлемо при лечении больных, находящихся в критическом состоянии.

Следует отметить, что вышеперечисленные методы индивидуального подбора препаратов для проведения иммунокорригирующей терапии часто оказываются неэффективными в клинике, что проявляется отсутствием ожидаемых изменений со стороны иммунного статуса больного. Указанные обстоятельства – методическая сложность, трудоемкость и длительность проведения проб, несовпадение клинического эффекта применения препаратов с результатами проб in vitr- явились факторами, ограничивающими использование предложенных нагрузочных проб в клинике.

 

Необходимость оперативного выбора в клинике наиболее эффективных иммуномодуляторов требует поиска других, более стабильных и точных критериев для оценки нагрузочных тестов. В качестве такого критерия оценки, по-видимому, можно использовать показатели внутриклеточного метаболизма лимфоцитов. Метаболические параметры этих клеток отражают реактивные изменения в организме, характер влияний его регуляторных систем и поэтому нередко оказываются информативными для суждения о глубине и динамике патологических процессов [79, 80, 83, 84].

 

Среди современных и наиболее простых в исполнении способов оценки состояния внутриклеточного метаболизма лимфоцитов достаточно широко используется биолюминесцентный метод определения в клетках активности дегидрогеназ [117], высокая информативность которого для характеристики функциональных возможностей лимфоцитов доказана многочисленными исследованиями [5, 13, 14, 17, 26, 118].

 

Вверх                     Содержание монографии 

 

1.6. Заключение

Сложность патогенеза перитонита определяет тяжесть состояния и трудность лечения этой категории больных. Высокая летальность при перитонитах подчеркивает актуальность существующей проблемы.

Подавление инфекционного процесса не является гарантией выздоровления. Благоприятный исход заболевания достигается только сочетанием хирургических методов санации гнойного процесса в брюшной полости с мероприятиями интенсивной терапии. Однако, несмотря на их применение, летальность при перитонитах остается высокой.

Иммунотропная терапия является патогенетически оправданным воздействием, ее проведение в составе комплексного лечения больных перитонитом предопределяет более благоприятный исход заболевания. Функциональные возможности иммунокомпетентных клеток детерминированы совокупностью структурно-метаболических параметров внутриклеточного метаболизма. Раскрытие механизмов их сопряжения с клиническими показателями состояния больного и показателями функционирования нейроэндокринной системы открывает возможность коррекции нарушений на внутриклеточном уровне.

Одним из перспективных направлений иммунокор-регирующей терапии является использование препаратов, устраняющих нарушения внутриклеточных обменных процессов. Основным принципом иммунотропной терапии, повышающей ее эффективность, является индивидуальный подбор препаратов. Существующие методики оценки прямого действия лекарственных средств на ИКК, в силу различных причин, не оправдывают себя в клинике. Более глубокие и стабильные данные о влиянии на клеточный метаболизм фармпрепаратов могут быть получены путем оценки изменения активности внутриклеточных биохимических процессов. Подобранные таким образом препараты должны оказывать целенаправленный клинический эффект, что позволит улучшить результаты лечения больных перитонитом.

 

Вверх                     Содержание монографии 

 

Глава 2. Материал и методы исследования

2.1. Материал исследования

Работа проведена на кафедре клинической иммунологии и в ЦНИЛ Красноярской государственной медицинской академии, в иммунологической лаборатории Краевого центра клинической иммунологии. Обследованы и получали лечение больные отделений гнойной хирургии и реанимации, детоксикации и эфферентной терапии Красноярского краевого гнойно-септического центра Краевой клинической больницы.

 

Всего обследовано 96 больных с распространенным гнойным перитонитом (диффузным и разлитым), диагноз которого определялся согласно классификации, рекомендованной Объединенным пленумом проблемных комиссий “Неотложная хирургия” и “Гнойная хирургия” Межведомственного научного совета по хирургии РАМН и Минздрава РФ (Ростов-на-Дону, 1999), а также 26 практически здоровых человек.

 

Большинство обследованных больных распространенным перитонитом составляли жители Красноярского края, ранее оперированные в районных больницах (ЦРБ) и доставленные службой санитарной авиации в ККБ в связи с ухудшением состояния и невозможностью оказания специализированной медицинской помощи по месту жительства.

 

К моменту поступления у больных наблюдалась типичная клиническая картина воспаления в брюшной полости. Сроки развития заболевания соответствовали токсической стадии перитонита (24-72 часов). У больных отмечались бледность кожных покровов, тахикардия (до 99,01±2,13 сокращений в минуту), снижение центрального венозного давления (до 45,05±3,87 см вод. ст.), тахипноэ (до 18,17±0,34 в минуту), сухость во рту, лихорадка (до 37,8±0,1С).

 

Обязательным проявлением продолжающегося гнойного воспаления в брюшной полости являлся парез кишечника, наличие гнойного отделяемого по дренажам, установленным интраоперационно в брюшной полости, а также напряжение мышц передней брюшной стенки. Всем больным при поступлении в ККБ экстренно выполнялись оперативные вмешательства, включавшие (ре)лапаротомию, ревизию, санацию, дренирование брюшной полости, ликвидацию очагов гнойной инфекции, трансназальную интубацию тонкого кишечника. При невозможности одномоментной адекватной санации брюшной полости или сомнительной эффективности проведенных мероприятий накладывалась лапаростома с интервалом повторных ревизий около 48 часов. В ряде случаев (10 больным) лапаростомы накладывались в районных больницах на этапе оказания квалифицированной медицинской помощи.

 

На основании оценки воспалительных изменений в брюшной полости на момент первого оперативного вмешательства, произведенного в ККБ, а также клинических данных (табл. 1.) больные были разделены на группы по тяжести заболевания на основании оценки по шкале Мангеймского индекса перитонита (МИП) . При значении МИП до 20 баллов тяжесть перитонита оценивали как легкую, при МИП от 20 баллов включительно до 30 баллов – как среднюю, при МИП 30 баллов и выше – течение перитонита оценивали как тяжелое.

 

Таблица 1

Мангеймский индекс перитонита (МИП)

 

Для уменьшения влияния других факторов на функционирование иммунной системы в исследование включены больные распространенным перитонитом не старше 50 лет, при отсутствии у них онкологических заболеваний.

 

Этиология перитонита в группах больных была различной (табл. 2).

 

Таблица 2

Этиология перитонита

 

Среди больных перитонитом выделены основная и контрольная группы. Критерием разделения больных на группы служило применение иммунотропных препаратов, выбранных на основании традиционных показаний к применению (клиническая картина и показатели иммунного статуса) или с учетом показателей нагрузочных проб in vitro. В основную группу больных вошли 30 человек, в контрольную – 66 человек. Основная и контрольная группы больных и группа здоровых лиц были сопоставимы по половому составу и возрасту. Распределение больных в группах по тяжести состояния приведено в таблице 3.

 

В основной и контрольной группах у больных при ревизии брюшной полости преобладал мутно-гнойный экссудат (серозно-фибринозный, серозно-гнойный, фибринозно-гнойный): 68,57% и 72,58% соответственно.

Результаты лабораторных исследований подтверждали наличие у всех больных лейкоцитоза, преимущественно со сдвигом формулы влево (увеличение доли палочкоядерных нейтрофилов до 10,09±1,17%). У больных перитонитом средней степени тяжести, на фоне угнетения функций костного мозга, отмечался нейтрофильный лейкоцитоз со сдвигом формулы вправо (до 74,67±1,47% сегментоядерных нейтрофилов). На высоте интоксикации развивалась спутанность сознания, гипертермия до 38-40ºС. Отмечалось повышение лейкоцитарных индексов интоксикации (табл. 8).

 

Параллельно с усугублением тяжести перитонита снижалась концентрация белка в плазме крови: 50,20±1,97 г/л, 47,97±1,69 г/л, 42,26±3,40 г/л у больных перитонитом легкой, средней и тяжелой степеней тяжести соответственно. При неэффективности инфузионной терапии использовались эфферентные методы детоксикации: проведение 1-2 сеансов ультрагемофильтрации (объем фильтрата 6-8 литров) или плазмафереза (500-800 мл в сочетании с УФОК) (табл. 4).

 

Таблица 3

Характеристика состояния больных перитонитом в группах

 

Антибактериальная терапия в условиях ЦРБ часто проводилась без учета чувствительности возбудителей к назначенным препаратам, вследствие чего имела неадекватный характер (табл. 4), что подтверждалось результатами микробиологических исследований. При поступлении в ККБ больным назначались антибактериальные препараты в сочетаниях, обеспечивающих широкий спектр бактерицидного действия. Наиболее часто использовалась комбинация цефалоспоринов третьего поколения (цефоперазон внутривенно капельно по 2,0 г 2 раза в сутки) с аминогликозидами (амикацин по 1,0 г внутримышечно 1 раз в сутки) и препаратами, действующими на облигатные анаэробы (метронидазол 0,5 г внутривенно капельно 3 раза в сутки). Тем не менее, в достаточно высоком проценте случаев (до 28,57%) это не обеспечивало адекватного воздействия на возбудителей инфекции и требовало смены препаратов с учетом антибиотикочувствительности культур микроорганизмов из очага воспаления. Материалом для микробиологического исследования служил экссудат из брюшной полости, получаемый интраоперационно. Предварительный результат чувствительности микроорганизмов к антибиотикам был известен спустя сутки, окончательный, включавший также идентификацию возбудителей, через 3 суток с момента забора материала. Выявление микроорганизмов, не чувствительных к назначенным препаратам, служило причиной замены антибактериальных препаратов на эффективные. Деэскалационная терапия гнойной инфекции включала использование имипенема / циластатина (Тиенама) по 0,5 г 4 раза в сутки внутривенно капельно (табл. 4).

 

Стабилизация гемодинамических показателей осуществлялась внутривенным введением допамина в диуретических дозах (3-5 мкг/кг веса в минуту) или кардиотонических дозах (5-10 мкг/кг веса в минуту) индивидуально в зависимости от тяжести состояния у больных перитонитом со значениями МИП свыше 20 баллов.

 

С учетом данных газового состава крови корректировались функции внешнего дыхания и состав вдыхаемой газовой смеси; большинству больных (при отсутствии противопоказаний) на протяжении пребывания в стационаре проводились сеансы гипербарической оксигенации (избыточное давление 1,0-1,5 атм., время изопрессии 40-45 минут, курс лечения 6-10 сеансов) (табл. 4).

 

Антистрессовые мероприятия включали обязательное применение у всех больных ганглиолитиков (пентамин 5% по 0,5 мл внутримышечно 4 раза в сутки), центральных α₁-адреномиметиков (клофелин 1,0-1,5 мкг/кг внутримышечно 3 раза в сутки), нейропептидов (даларгин по 0,001-0,003 г внутримышечно 3 раза в сутки) и Н₂-блокаторов (квамател 0,02 г внутривенно капельно 2 раза в сутки).

 

Питание больных в послеоперационном периоде начинали с парентеральных препаратов («Аминосол», «Аминоплазмаль», «Инфезол», «Липофундин») в сочетании с зондовыми смесями («Нутризон»). Восстановление моторики кишечника стимулировалось медикаментозно (метоклопрамид, убретид) и рефлекторно (гипертонические клизмы). Назоинтестинальный зонд удалялся при восстановлении самостоятельного стула, четкой аускультации перистальтических шумов и сброса кишечного содержимого по зонду менее 1 литра в сутки.

 

Таблица 4

Характеристика основных методов лечения больных перитонитом

Примечания: 1)*-приведено число пациентов с соответствующим методом лечения; 2) достоверных различий между показателями групп не установлено.

 

У части больных перитонитом к моменту поступления в ККБ развивалась клиника синдрома системного воспалительного ответа (табл. 3), которую с учетом существования очага инфекции в брюшной полости расценивали как абдоминальный сепсис [1]. Критериями его диагностики являлись: частота сердечных сокращений более 90 в минуту, частота дыхания более 20 в минуту, температура тела выше 38,0ºС, число лейкоцитов более 12,0*10⁹/л, доля сегментоядерных нейтрофилов более 10%.

 

Вариантов ССВО с лейкопенией менее 4,0*10⁹/л и температурой тела ниже 36,0ºС среди обследованных больных не отмечено. Вероятно, это было обусловлено тем, что данное состояние, как правило, развивается у больных старших возрастных групп; нами же обследованы больные не старше 50 лет.

 

Абдоминальный сепсис встречался в 23,08%, 36,96%, 72,73% у больных перитонитом легкой, средней и тяжелой степеней тяжести соответственно. У части больных не удавалось достичь купирования гнойного воспаления, и на этом фоне развивалась клиника полиорганной недостаточности с нарушением функций легких, печени, почек, сердечно-сосудистой системы, высших корковых функций. Угнетение кроветворения выражалось в меньшем, чем при легком и средней степени тяжести перитоните, количестве лейкоцитов и углублением лимфопении у большинства больных на фоне ухудшения состояния.

 

Показаниями для иммунологического обследования являлись распространенный характер гнойного воспаления в брюшной полости, лимфопения, отсутствие положительной динамики после оперативных вмешательств. Исследование исходных параметров иммунного статуса и структурно-метаболических показателей лимфоцитов (активности дегидрогеназ лимфоцитов в пробах in vitro, состава жирных кислот лимфоцитов) производилось после выполнения первого оперативного вмешательства в условиях ККБ (рис. 1) и установления диагноза распространенного перитонита в течение первых суток пребывания больного в стационаре (табл. 3).

 

Метаболические иммунокорректоры (реамберин, глутоксим, пирацетам) назначались в те же сроки на основании клинических показаний как с целью нормализации функций иммунной системы, так и в качестве компонента детоксикационной терапии [67]. Наличие иммунологических нарушений (Т-иммунодефицит 2 степени, снижение ИРИ менее 0,8, ФИ ниже 40%, продукции иммуноглобулинов: IgA<1,4 г/л, IgM<0,5 г/л, IgG<8,0 г/л) служило основанием для назначения препаратов, обладающих иммунорегуляторным эффектом (имунофан, полиоксидоний). Курс иммунокоррекции проводился параллельно с хирургическим лечением воспаления брюшины и начинался с назначения одного из препаратов метаболического ряда, затем, спустя 1-2 суток, назначались иммунорегуляторы. Общая продолжительность курса иммунокорригирующей терапии составляла 5-7 дней. Контрольное исследование иммунного статуса и метаболических показателей лимфоцитов выполнялось непосредственно после проведения курса иммунокоррекции (рис. 1).

 

Рис. 1. Примерная схема иммунологического обследования, иммунокоррекции и хирургического лечения больных распространенным перитонитом

 

Все использованные для лечения больных препараты зарегистрированы на территории Российской Федерации и разрешены для клинического применения Фармакологическим комитетом РФ. В нашем исследовании мы использовали стандартные схемы назначения препаратов (табл. 6). Общепринятыми показаниями для назначения иммунокорректоров у больных гнойной хирургической инфекцией считаются показания, представленные в таблице 5 [119]. Более подробно клиническая характеристика групп приведена в пятой главе работы.

 

Таблица 5

Показания и противопоказания к назначению препаратов у больных с гнойной хирургической инфекцией

 

Вверх                     Содержание монографии 

2.2. Методы исследования

 

2.2.1. Общеклинические методы

Для контроля за течением заболевания и эффективностью проводимых мероприятий учитывались следующие параметры:

• показатели периферической крови: количество лейкоцитов (L, *10⁹/л), абсолютное количество лимфоцитов (АКЛ) в мкл; показатели лейкоцитарных индексов интоксикации (ЛИИ): по Я.Я.Кальф-Калифу (ЛИИкк), по В.К.Островскому (ЛИИос), по С.Ф.Химич в модификации А.Л.Костюченко с соавт. (ЛИИх) [67]:

ЛИИкк = ((4*мц+3*ю+2*п/я+с/я)*(пл+1))/((э+1)*(лф+мн)); 

ЛИИос = (мц+ю+п/я+с/я+пл)/(э+лф+мн); 

ЛИИх = 0,1*L*н/(100-н); 

где мц, ю, п/я, с/я, э, лф, мн, пл, н – процентное содержание миелоцитов, юных нейтрофилов, палочкоядерных нейтрофилов, сегментоядерных нейтрофилов, эозинофилов, лимфоцитов, моноцитов, плазматических клеток и суммы нейтрофилов в мазке периферической крови, L – лейкоциты, *10⁹/л;

• индекс стресса (ИСтр) - соотношение процентного содержания лимфоцитов и сегментоядерных нейтрофилов в мазке периферической крови, отражающее глубину и стадию стрессовой реакции организма (по Л.Х.Гаркави и др., 1987) [24, 87] и вычисляемое по формуле:

ИСтр = лф / с/я;

• индекс Кердо (ИК), отражающий преобладание тонуса симпатического (индекс имеет положительное значение) или парасимпатического (индекс отрицательный) отделов вегетативной нервной системы [42]:

ИК = (1-АД_Дд/ЧСС)*100%,

где АД_Д – величина диастолического давления, мм рт. ст., ЧСС – число сердечных сокращений в одну минуту.

• показателя минутного объема кровотока (МОК), определяемый непрямым способом Лилье-Штандера и Цандера [42]:

МОК = (АД_С – АД_Д)*ЧСС*200 / (АД_С + АД_Д),

где МОК - минутный объем кровотока в мл, АД_С и АД_Д – величины систолического и диастолического давления соответственно, выраженные в мм рт. ст., ЧСС – число сердечных сокращений в одну минуту;

• длительность лечения;
• число оперативных вмешательств;
• летальность в контрольной и основной группах больных.

 

2.2.2. Иммунологические методы

Исследование иммунного статуса в динамике заболевания проводилось в соответствии с общепринятыми рекомендациями [39, 71, 80, 106, 139, 140]. Учитывая циркадные суточные ритмы клеточных популяций [76, 177], для оценки иммунного статуса использовали лишь результаты утренних исследований.

Фенотип лимфоцитов обследуемых лиц оценивался методом непрямой флуоресценции с мышиными моноклональными антителами на люминесцентном микроскопе «Люмам И-1». На лимфоцитах определялось наличие молекул различных CD-рецепторов: CD3 (Т-лимфоциты), CD4 (Т-хелперы), CD8 (цитотоксические клетки / Т-супрессоры). Использовались моноклональные антитела, производимые ЗАО «Сорбент».

Концентрация сывороточных иммуноглобулинов А, М, G определялась методом иммунопреципитации в агаровом геле [253].

Уровень общего IgE в сыворотке крови оценивали моноклональными антителами, согласно инструкции по применению иммуноферментной тест-системы АОЗТ «Биоиммуноген» (г.Москва).

Выявление циркулирующих иммунных комплексов проводилось после инкубации с раствором ПЭГ-6000 с учетом результатов на фотоэлектроколориметре при длине волны 315 нм [299].

 

2.2.3. Выделение лимфоцитов из периферической крови

Для изучения структурно-метаболических параметров лимфоцитов их выделяли из периферической крови обследованных лиц по методике А.Boyum (1968). Выделение клеток производили из стабилизированной 2,7% раствором ЭДТА цельной венозной крови. После 3-кратного ее центрифугирования в течение 5-7 минут при 1000 об/мин. полученную плазму, обогащенную лейкоцитами, наслаивали на раствор фиколл-верографина (р=1,077 г/см³) и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 30 минут. Клетки, остающиеся на фиколл-верографине, собирали при помощи пастеровской пипетки и ресуспендировали в забуференном физиологическом растворе NaCl (рН=7,4). Отмывка суспензии клеток производилась их центрифугированием при 1500 об/мин в течение 7 минут в забуференном физиологическом растворе. После этого сливали супернатант и клетки вновь ресуспендировали в 1 мл физраствора. Концентрацию полученной клеточной суспензии подсчитывали на счетчике “Picoscale PS-4”.

Чистота взвеси выделеных лимфоцитов в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимза, составляла 95-96%.

 

2.2.4. Исследование жирнокислотного спектра лимфоцитов

Для определения жирнокислотного спектра лимфоцитов липиды из клеток экстрагировали по методу Folch еt al (1957) [202]. Исследование проводили на газожидкостном хроматографе «Хром-5» (Чехословакия) с плазменно-ионизационным детектором. Применяли стеклянную колонку, заполненную жидкой фазой - диэтилен гликольсукцинатом на хромосорбе DMCS.

В жирнокислотном спектре липидов лимфоцитов были определены объемы 10 жирных кислот: С_16:0 - пальмитиновая кислота, С_16:1 - пальмитоолеиновая кислота, С_18:0 - стеариновая кислота, С_18:1 - олеиновая кислота, С_18:2 - линолевая кислота, С_18:3 - линоленовая кислота, С_20:0 - эйкозановая кислота, С_20:3 - эйкозотриеновая кислота, С_20:4 - арахидоновая кислота, С_20:5 - эйкозопентаеновая кислота.

На основании полученных данных вычисляли сумму насыщенных жирных кислот (С_16:0+С_18:0+С_20:0), сумму ненасыщенных жирных кислот (С_16:1+С_18:1+С_18:2+С_18:3+С_20:3+С_20:4+С_20:5), сумму моноеновых жирных кислот (С_16:1+С_18:1), сумму полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) - С_18:2+С_18:3+С_20:3+С_20:4+С_20:5, коэффициенты насыщенности (насыщенные ЖК/ ненасыщенные ЖК и насыщенные ЖК/ПНЖК), сумму ω-3 (С_18:3+С_20:5) и ω-6 (С_18:2+С_20:3+С_20:4) жирных кислот.

 

2.2.5. Определение содержания катехоламин-рецепторных комплексов в лейкоцитах периферической крови

Определение содержания в лейкоцитах катехоламин-рецепторных комплексов проводили люминесцентно-гистохимическим методом Фалька-Хилларпа [153]. Метод основан на превращении первичных и вторичных аминов под действием газообразного формальдегида в четвертичные амины - дериваты изохинолина, которые при воздействии ультрафиолетового излучения флуоресцируют в зеленом отрезке видимого света.

Мазки готовили путем смешивания на стекле 20 мкл цельной крови с 20 мкл 5% MgSO₄ и последующего высушивания на воздухе. После дополнительного высушивания струей горячего воздуха в течение 15 минут мазки выдерживались в вакууме (0,5 атм) в течение 30 минут. После этого мазки помещали в эксикатор с фиксированной влажностью паров, для чего в эксикатор емкостью 2 л вносили 1,244 г параформа и 350 мкл дистиллированной воды. Эксикатор с мазками термостатировали в сухожаровом шкафу при 80С в течение 1 часа. Обработанные мазки исследовали при помощи флуоресцентного микроскопа “ЛЮМАМ-Р3” с насадкой ФМЭЛ (напряжение 700В, сопротивление 5010 Ом, зонд 0,5, заградительный фильтр №4 - 480 нм). Эталонный фон измеряли на стандартном стекле-мишени. Показателем количества биогенных аминов в лимфоцитах считали интенсивность флуоресцентного сигнала после усиления ФМЭЛ, выраженную в мкВ с учетом фонового значения светимости.

 

2.2.6. Определение активности внутриклеточных ферментов лимфоцитов

Активность внутриклеточных ферментов в лимфоцитах крови изучалась биолюминесцентным методом с бактериальной люциферазой [117].

Суспензию лимфоцитов, содержащую 500 тыс. клеток, дважды замораживали и размораживали, добавив для дополнительного разрушения лимфоцитов 5-кратный объем дистиллированной воды. В приготовленную инкубационную смесь, содержащую соответствующий для определяемого фермента субстрат и кофактор, вносили суспензию разрушенных лимфоцитов в дозе, адекватной 10000 клеток. Концентрации субстратов, кофакторов и рН инкубационной среды приведены в таблице 6.

 

Таблица 6

Концентрация субстратов, кофакторов и рН среды для определения активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах

 

В дальнейшем инкубационную смесь термостатировали при 37ºС в течение 30 минут. Затем для определения активности каждой дегидрогеназы 200 мкл проинкубированной смеси добавляли в кювету биолюминометра “БЛМ-8801” (СКБ “Наука”, г. Красноярск), содержащую 50 мкл ФМН в концентрации 1,50*10^-5 М и 50 мкл 0,0005% альдегида С₁₄. Для активации биолюминесцентной реакции в кювету вносилось 10 мкл ферментативной системы НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза. Все реактивы биолюминесцентной системы разводились в 0,1 М K+,Na+-фосфатном буфере с рН 7,0. При определении активности НАД(Ф)ИЦДГ в инкубационную смесь дополнительно вносили АДФ в концентрации 2,15 мМ.

 

Активность ферментов вычислялась по количеству наработанного в процессе инкубации пробы НАДН или НАДФН, содержание которых было пропорционально интенсивности биолюминесценции. По напряжению на фотоэлектроумножителе прибора измеряли уровень биолюминесценции и при помощи калибровочной кривой определяли концентрацию НАД(Ф)Н в пробе.

 

Для построения графика зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации НАД(Ф)Н (калибровочный график) 200 мкл стандартного раствора НАД(Ф)Н в диапазоне 10^-9-10^-4 М вносили в кюветы биолюминометра, содержащие указанные выше реактивы в тех же концентрациях, после чего производилось измерение интенсивности биолюминесценции. В связи с широким диапазоном рН буферов, используемых для определения дегидрогеназной активнос­ти, а также рН-зависимостью ферментативных систем, калибровочные графики строились для каждого значения рН буфера.

 

Активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ рассчитывали по формуле

А = ([C]*V*10-6) / T, 

где [C] – концентрация НАД(Ф)Н в пробах, V - объем пробы в мл, Т - время инкубации в минутах. Активность ферментов выражали в ферментативных единицах (мкЕ) на 10000 клеток (1мкЕ=1мкмоль/мин) [127].

 

Рис. 2. Основные пути метаболизма лимфоцита.

Примечание: в овальных рамках приведены названия исследованных ферментов; по условиям методики определялась активность прямых реакций, контролируемых НАД/Ф/ГДГ (производство aльфа-кетоглутората).

 

При проведении исследования определялась активность: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ); глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (Г3ФДГ), лакатдегидрогеназы (ЛДГ), НАД- и НАДФ-зависимой малатдегидрогеназ (НАДМДГ и НАДФМДГ); НАД- и НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназ (НАДИЦДГ и НАДФИЦДГ); НАД- и НАДФ-зависимой глутамат-дегидрогеназ (НАДГДГ и НАДФГДГ).

На рисунке 2 представлены основные метаболические пути лимфоцита, контролируемые исследованными ферментами.

 

2.2.7. Инкубация лимфоцитов с иммунотерапевтическими препаратами

Для определения изменений активности внутриклеточных дегидрогеназ в лимфоцитах под влиянием их инкубации с различными препаратами нами использовалась следующая схема. Суспензию выделенных лимфоцитов (0,5 млн. клеток) инкубировали в физиологическом растворе (1,0 мл) с терапевтическими концентрациями реамберина, глутоксима или пирацетама при 37С в течение 60 минут (табл. 7.).

Контрольными для показателей активности дегидрогеназ в лимфоцитах, инкубированных с препаратами, являлись аналогичные показатели лимфоцитов, которые инкубировались в физрастворе без добавления препаратов. Время инкубации выбрано в соответствии с биоритмическими характеристиками клеточных популяций [11, 12, 44]. После инкубации лимфоциты разрушали замораживанием-размораживанием и осмолизисом, а затем в суспензии разрушенных клеток определялась активность ферментов по представленной выше методике [117].

 

Таблица 7

Концентрация действующих веществ в инкубационной смеси

№ препарата	Препарат	Концентрация, г/л
1.	Реамберин	0,6
2.	Глутоксим	2*10-3
3.	Пирацетам	5*10-2

 

Изменения активности ферментов после инкубации клеток с препаратами выражались в процентах и определялись по формуле

DЕ = Е_П * 100% / Е_ИК ,

где DЕ - активность дегидрогеназы опытной пробы с препаратом по отношению к показателю инкубированной контрольной пробы, Е_П и Е_ИК – активность дегидрогеназы в опытной и инкубированной контрольной пробах соответственно.

 

2.2.8. Оценка экономической эффективности внедрения метода индивидуального подбора метаболических иммунокорректоров для лечения больных перитонитом

В основу оценки эффективности предложенного метода индивидуального подбора иммунокорректоров для лечения больных перитонитом положен анализ «затраты-эффективность» [88]. Согласно общепринятым стандартам оценки, в аналитических расчетах учтены снижение затрат на лечение за счет уменьшения продолжительности пребывания в стационаре. Средняя стоимость стационарного лечения в Красноярском краевом гнойно-септическом центре с учетом стоимости пребывания, диагностики и лечения составляет 3498,76 рублей в сутки.

 

За период с 1999 по 2002 гг. в Красноярской краевой клинической больнице (ККБ) ежегодно проходило лечение в среднем 108,24±3,02 больных перитонитом. Распространенный перитонит без онкопатологии встречался у 59,00±2,00 человек. Среди них 67,12%, или 39,60 человека в год, составляли лица моложе 50 лет.

 

В качестве дополнительных затрат на внедрение метода в клинике взяты следующие показатели: стоимость расходных материалов на производство анализов, оплата труда персонала лабораторий, занятого в производстве анализов, а также стоимость биолюминометра производства СКТБ »Наука», г.Красноярск (115150,00 рублей). Поскольку внедрение метода не требовало использования дополнительного лабораторного оборудования, амортизационные расходы не учитывались.

 

Согласно нормативным документам [110], проведение одного люминесцентного исследования требует 35 минут рабочего времени среднего персонала и 5 минут рабочего времени врачебного персонала лабораторий. Количество рабочего времени на 1 ставку для лабораторной службы составляет 7329 минут в месяц. Средний месячный оклад с учетом районного коэффициента составляет для врача высшей категории 3532,20 рублей, для фельдшера-лаборанта высшей категории – 2795,60 рублей.

 

Эффективность внедрения метода в клиническую практику рассчитывалась как разность между затратами и снижением материального ущерба. Последний составляли экономия материальных средств за счет уменьшения продолжительности пребывания больных в стационаре.

 

2.2.9. Статистическая обработка результатов

Статистическая обработка результатов производилась с использованием общепринятых в биологии и медицине методов анализа данных [146]. Расчеты выполнены на персональном компьютере с помощью пакета статистических программ “Statistica for Windows 6.0”.

 

В качестве основных статистических параметров учитывали среднее арифметическое значение величин (M) и их стандартную ошибку (m). Нулевая гипотеза проверялась сопоставлением экспериментального и критического значений U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни и F-критерия Фишера. При дисперсионном анализе для оценки силы влияния признака использовали показатель n². Летальность больных в группах сравнивали с помощью критерия x² Пирсона. За достоверные различия принимали данные с P<0,05; показатель P<0,1 оценивали как тенденцию к достоверности различий.

Вверх

3-я часть                       4-я часть            3 глава 4-й части

Содержание монографии