Глава 2. Материалы и методы исследования

1-я глава 3-й части           2 глава            3-4 главы 3-й части

Содержание монографии

 

Глава 2. Материалы и методы исследования

 

Содержание 2-й главы:

2.1. Экспериментальная часть

2.2. Клиническая часть

2.3. Общеклинические методы исследования

2.4. Методы оценки иммунного статуса

2.5. Оценка метаболических и липидных параметров

2.6. Методы математического анализа

2.7. Использованные схемы лечения больных острым панкреатитом

2.1. Экспериментальная часть

Экспериментальная часть выполнена на 30 белых крысах линии ”Vister” массой 200-250 гр. Всего произведено 3 серии опытов, распределение животных по сериям представлено в таблице 1.

 

Таблица 1

Распределение опытов по сериям

№	Кол-во	Характер эксперимента	Метод лечения
1-я группа
1.	10крыс	Здоровые животные, изучение исходных контрольных данных	Без лечения
2-я группа
2.	10крыс	Отработка модели ОПГП	Без лечения
3-я группа Изучение применения ОФР в лечении острого панкреатита.
3.	10крыс	Модель ОПГП	Лаваж брюшной полости ОФР

 

Накануне проведения эксперимента животных в течение 12 часов не кормили. Пользовались эфирным наркозом, осуществляя его затравкой животного в банке, на дне которой находился тампон, смоченный эфиром.

 

Используемая модель экспериментального острого панкреатита (ЭОП) относится к моделям гипертензионного происхождения (или каналикулярно-гипертензионного по Шалимову А.А. и др.(1983)), которые основаны на создании повышенного гидростатического давления в панкреатическом протоке (окклюзия эмболом, перевязка панкреатического протока, создание дуоденостаза и прочие). В целом эта группа методов отражает теорию «общего канала» [51].

 

Операция по моделированию экспериментального острого панкреатита заключалась в следующем: брюшная полость вскрывалась срединным доступом с помощью специального набора инструментов, производилась ревизия органов брюшной полости. В рану выводили участок ДПК в области впадения в нее общего желчного протока (рисунок 6).

 

После выведения ДПК прошивали и лигировали общий желчный проток в бессосудистой зоне, затем погружали в брюшную полость (рисунок 7).

 

Рану передней брюшной стенки ушивали послойно двумя рядами шелковых швов. Оперативное вмешательство выполнялось в течение 3-5 минут. Выбранная модель хорошо воспроизводима и позволяет получить острый отечный панкреатит в 100% случаев, что подтвердило вскрытие животных.

 

Начиная с первых суток после воспроизведения острого панкреатита, у всех крыс появлялись признаки нарушений в виде ухудшения общего состояния, отказа от пищи и воды, вялости, безразличия к раздражителям, снижалась масса тела. Внешний вид животных также ухудшался – шерсть теряла блеск, становилась “ершиком”.

 

 

Рис. 6. Область впадения желчного протока в ДПК

 

 

Рис. 7. Прошивание желчного протока

При макроскопии определялись кровоизлияния и стеатонекрозы в ткани железы, ферментативный перитонит и стеариновые бляшки на висцеральной брюшине, паретически раздутые петли кишечника (рисунок 8).

 

 

Рис. 8. Экспериментальный панкреатит

Все крысы были подвергнуты аутопсии с забором крови и взятием биоптатов из ткани поджелудочной железы.

 

Вверх               Содержание монографии

 

2.2. Клиническая часть

 

Работа проведена на базе 1-го и 2-го хирургических отделений, отделения интенсивной терапии и реанимации ГКБ N7 г.Красноярска. Под наблюдением находилось 83 больных с различными формами острого панкреатита.

 

В зависимости от формы ОП были выделены две клинические группы: больные отечной формой острого панкреатита (ОФОП) – 54 чел. (78,3%) и деструктивной формой заболевания (ДФОП) – 29 чел. (21,7%).

 

Результаты распределения больных по этиологическому фактору представлены в таблице 2.

 

Среди больных преобладали женщины (64%). Это, по-видимому, связано с более высокой частотой встречаемости у них желчнокаменной болезни и нарушений жирового обмена. Значительная часть больных – лица среднего и пожилого возраста (58%).Сроки поступления в стационар колебались от 24 до 48 часов с момента начала заболевания.

 

Таблица 2

Этиологическая структура больных острым панкреатитом в зависимости от клинической формы заболевания

№	Показатель	Форма острого панкреатита
		Отечный		Деструктивный
1.	Число больных	54	65,1%	29	34,9%
2.	Возраст, годы	36,78±11,38		43,41±13,86
3.	Этиология: алкогольный билиарный травматический после ЭРХПГ, ЭПСТ не установлена	28 20 1 - 5	51,8% 37,0% 1,8% - 9,2%	13 11 1 1 3	44,8% 37,0% 3,4% 3,4% 10,3%

 

В таблице 3 показано деление больных по степени распространенности процесса в поджелудочной железе.

 

Таблица 3

Распределение больных по степени распространенности процесса в поджелудочной железе

 

Вверх               Содержание монографии

 

2.3. Общеклинические методы исследования

 

Общеклинические методы исследования включали общий осмотр, термометрию, измерение артериального давления, ФГС, УЗИ ГПДЗ. У всех больных брали кровь для клинического анализа с подсчетом количества эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов и определения скорости оседания эритроцитов.

 

Биохимическое исследование включало следующие параметры: билирубин, мочевина, креатинин, общий белок, протеинограмма, активность аспартат- и аланин аминотрансфераз (АсАТ, АлАТ) с расчетом коэфициента де Ритиса (АсАТ/АлАТ), щелочной фосфатазы (ЩФ) и гамма-глутамилтрансферазы (Г-ГТФ).

 

Билирубин определяли методом Индрашека, мочевину по цветной реакции с диацетилмонооксимом, креатинин – по Попперу, общий белок по метду Лоури, белковые фракции электрофоретическим методом, АсАТ и АлАТ по методу Райтмана и Френкеля. Щелочную фосфатазу по Бодански, Г-ГТФ спектрофотометрическим методом.

Данные общеклинических методов исследования заносились в карты наблюдения.

 

Вверх               Содержание монографии

 

2.4. Методы оценки иммунного статуса

 

В работе для оценки иммунного статуса больных производилось: определение показателей лейкограммы, показателей клеточного, гуморального звеньев иммунитета, а также изучение структурно-метаболических параметров лимфоцитов.

 

Для определения лейкограммы у обследуемых утром натощак производился забор крови из пальца. Абсолютное количество лейкоцитов определяли в камере Горяева по общепринятой методике. Морфологию лейкоцитов и процент каждой популяции просчитывали после окраски мазка крови азур-эозином. Далее подсчитывалось абсолютное количество лимфоцитов [81].

 

Одновременно с забором крови из пальца производили забор крови из локтевой вены для выделения лимфоцитов, которые в дальнейшем использовались для фенотипирования моноклональными антителами и определения структурно-метаболических параметров (активности ферментов и липидного спектра). Консервантом служил 0,6% охлажденный до 4-5С раствор ЭДТА на физиологическом растворе, который смешивали с кровью в соотношении 1:9 (Новиков Д.К., Новикова В.И., 1996). Выделение взвеси лимфоцитов из крови производили по A.Boyum (1968). Для последующего определения активности ферментов лимфоцитов отделяли 1 млн клеток и замораживали их при температуре –20ºС, для изучения липидного спектра замораживали 2 млн клеток.

 

2.4.1. Определение фенотипа лимфоцитов с помощью  моноклональных антител

Фенотипирование лимфоцитов проводилось методом непрямой иммунофлюоресценции с помощью мышиных моноклональных антител к молекулам различных CD-рецепторов лимфоцитов. Анализ образцов проводился на люминесцентном микроскопе Люмам И-1. При постановке реакции учитывались рекомендации Р.М.Хаитова, Б.В.Пинегена (1995). В работе использовались мышиные моноклональные антитела ЗАО «Сорбент» к CD3 (Т-лимфоциты), CD4 (Т-хелперы), CD8 (Т-супрессоры), CD19 (В-лимфоциты), меченные ФИТЦ.

 

2.4.2. Оценка состояния гуморального звена иммунитета

Количество В-лимфоцитов определялось по экспрессии рецепторов СД-19 в реакции непрямой иммунофлюоресценции. Функциональная активность В-лимфоцитов подсчитывали по уровню основных классов иммуноглобулинов в сыворотке крови – IgA, IgG, IgM. Концентрация сывороточных иммуноглобулинов A, M, G определялась по методике радиальной иммунодиффузии (G.Мanchini et аl., 1964) при помощи диагностических моноспецифических сывороток человека. Эта методика основана на измерении кольца преципитации, образующегося при внесении исследуемой сыворотки в лунки, вырезанные в слое агара, в который предварительно диспергирована моноспецифическая сыворотка. В стандартных условиях опыта диаметр кольца преципитации прямо пропорционален концентрации исследуемого иммуноглобулина. Содержание иммуноглобулинов устанавливали относительно контрольной сыворотки крови человека с известной концентрацией иммуноглобулинов.

 

Вверх               Содержание монографии

 

2.5. Оценка метаболических и липидных параметров

 

2.5.1. Тонкослойная хроматография липидов лимфоцитов

Для проведения тонкослойной хроматографии брали пробу, содержащую 2,0* 10⁶ лимфоцитов. В дальнейшем экстракцию липидов из пробы проводили по методу Фолча с соавт. (1957). После экстракции липидов в смеси хлороформ-метанола (2:1 по объему) и ее упаривания, экстракт наносили на силуфолевые пластины фирмы “Cavaler’, которые заранее активировались при 110ºС в течение 1 часа.

 

Разгонка липидных фракций на пластинах осуществлялась при предварительно насыщенных в течении 2-2,5 часов парами хроматографической смеси (гексан, этиловый эфир, ледяная уксусная кислота в объемном соотношении компонентов 85:15:1). После разгонки фракций пластины просушивали, опрыскивали 5% раствором фосфорномолибденовой кислоты в 96% этаноле и прогревали до 110-120ºС в сухожаровом шкафу.

 

Следующим этапом анализа липидного спектра лимфоцитов крови была обработка силуфолевых пластин на денситометре “Хромоскан-200”. Сначала на приборе описывались пики, соответствующие по своим размерам величине липидных фракций, а затем интегратором денситометра определялась доля каждого из пиков. В дальнейшем обработку денситограмм производили на ПЭВМ, на котором обсчитывался процент каждой фракции липидов.

 

2.5.2. Тонкослойная хроматография ткани поджелудочной железы

Липидный спектр ткани поджелудочной железы исследовали с помощью метода тонкослойной хроматографии. К 3-4 мг ткани, полученной в ходе эксперимента, после замораживания-размораживания, гомогенизации и осмотического лизиса дистиллированной водой добавляли 3-4 мл смеси хлороформ-метанола (2:1 по объему) и оставляли при комнатной температуре на 1 сутки для экстракции липидов. Затем хлороформную фазу смеси, содержащую липидный экстракт, при комнатной температуре упаривали досуха при пониженном атмосферном давлении. После этого в пробирку вносили 40 мкл хлороформа и растворяли в нем сухой остаток. Хлороформный раствор липидов наносили на силуфолевые пластины и разгоняли в хроматографической камере смесью растворителей гексан – этиловый эфир – ледяная уксусная кислота (85:15:1 по объему). Объем липидных фракций оценивался на денситометре “Хромоскан-200” по размеру и интенсивности их пятен, проявленных опрыскиванием 5% раствором фосфорномолибденовой кислоты на 96% этаноле и воздействием температуры 110-120ºС.

 

Методом тонкослойной хроматографии с последующей денситометрией определялись объемы фракций липидов: суммарных фосфолипидов, холестерина, свободных жирных кислот, триацилглицеридов, эфиров холестерина (ФЛ, ХОЛ, СЖК, ТАГ, ЭХ).

 

2.5.3. Определение активности НАД(Ф)–зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах

 

Активность ферментов выявляли по методике Савченко А.А., Сунцова Л.Н., (1989) [133]. При помощи биолюминсцентного метода подсчитывали содержание следующих ферментов лимфоцитов: Г6ФДГ, Г3ФДГ, ЛДГ, НАДМДГ, НАДФМДГ, НАДГДГ, НАДФГДГ, НАДИЦДГ, НАДФИЦДГ и ГР.

 

Для разрушения мембран лимфоцитов помимо осмотического лизиса использовали раствор детергента – ДТТ в концентрации 0,001 М. Из пробы забирали 50 МКЛ суспензии и вносили в инкубационную смесь, содержащую субстрат и кофактор для конкретного фермента. Инкубационную смесь, в составе которой были исследуемый фермент, субстрат и кофактор инкубировали в термостате при 37ºС – 30 минут. Затем 150 мкл инкубированной смеси вносили в кювету биолюминометра БЛМ-8801 (производитель СКТБ “Наука” г.Красноярск), содержащую 50 мкл раствора ФМН в концентрации 0,000015 М, 10 мкл смеси ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза и 50 мкл раствора альдегида С14 . Перечисленные растворы, составляющие биолюминсцетную систему, предварительно разводились в 0,1 М К_-Na- фосфатном буфере с рН 7,0. Кювету помещали в биолюминометр и учитывали уровень биолюминсценции до его максимума. Активность ферментов определялась по калибровочному графику и выражалась в международных ферментативных единацах на 10000 лимфоцитов, где Е= 1 мкмоль.

 

Концентрации субстратов, кофакторов и рН среды для исследуемых ферментов представлены в таблице 4.

 

Таблица 4

Значения рН буфера для установления активности ферментов

 

Примечание: среды с рН 9,0 и 9,8 были приготовлены на трис-буфере с рН 7,0, 7,4 и 7,8 – на К+, Na+ – фосфатном буфере.

 

Рабочий раствор трис-буфера с рН= 9,0 готовили каждый день работы с методикой заново. Ферментативная система, использованная для определения дегидрогеназ, включала в себя ФМН-оксидоредуктазу и люциферазу светящихся бактерий. Принцип реакций:

 

+оксидоредуктаза

1) ФМН + НАД/Ф/Н + Н ----------------------- ФМН Н + НАД/Ф/.

 

+люцифераза

2) ФМН Н + RCHO + О ----------------------- ФМН + Н О + RCOOH + Rn

 

где RCHO – алифатический альдегид, RCOOH – жирная кислота, Rn – квант света.

 

В ходе реакции происходит высвобождение квантов света, которые улавливаются фотоэлектроумножителем биолюминометра.

 

НАД(Ф)Н-реагент – это лиофилизированная смесь ферментов люциферазы и оксидоредуктазы. Полученные показатели активности ферментов несколько отличаются от показателей, приводимых для здоровых лиц авторами указанной методики. Это связано с тем, что в авторском варианте метода выделенные из крови лимфоциты отмываются и консервируются (до определения в них активности ферментов) замораживанием в культуральной среде 199, содержащей большое количество самых разнообразных субстратов метаболизма. Последнее обстоятельство способно существенно влиять на уровень определяемых ферментных показателей и поэтому с целью исключения этого влияния для отмывания и дальнейшей консервации клеток мы использовали забуферный изотонический раствор NaCl.

 

Для изготовления НАД(Ф)-реагента применяют очищенные методом ионообменной хроматографии и гель-фильтрации люциферазы из светящихся бактерий Photobacterium leiognathi и оксиредуктаза из Vibrio fischeri (Институте биофизики СО РАН [147]).

 

2.5.4. Определение активности НАД(Ф) – зависимых дегидрогеназ в ткани поджелудочной железы

Из участков ткани поджелудочной железы, по макроскопической оценке не подвергнутых изменениям (в контрольной группе) или с проявлениями панкреатита (в группах 2-ой и 3-ей), производилось выделение фрагмента массой 5-10 мг для определения активности метаболических ферментов и липидного спектра клеток железы.

 

Ткань поджелудочной железы с фиксированной на аналитических весах массой (2-3 мг) разрушали в гомогенизаторе (механически, затем замораживание-размораживание и лизис при добавлении дистилированной воды) и полученную суспензию центрифугировали 10 минут при 3000 об/мин. В надосадочной жидкости определяли активность внутриклеточных НАД(Ф)-зависимых ферментов описанным выше биолюминесцентным методом; результаты исследования выражались в мкЕ на 1 микрограмм ткани.

 

2.5.5. Определение активности НАД(Ф) – зависимых дегидрогеназ в цельной крови

 

Для определения ферментов цельной крови у обследуемых утром натощак производился забор крови из пальца. Кровь с добавлением гепарина замораживали, затем разрушали в гомогенизаторе (механически, затем замораживание-размораживание и лизис при добавлении дистилированной воды) и полученную суспензию центрифугировали 10 минут при 3000 об/мин. В надосадочной жидкости определяли активность внутриклеточных НАД(Ф)-зависимых ферментов описанным биолюминесцентным методом; результаты выражались в мкЕ на 1 микрограмм ткани.

 

Общий объем лабораторных исследований представлен в таблице 5.

 

Таблица 5

Объем и виды проведенных исследований

 

Вверх               Содержание монографии

 

2.6. Методы математического анализа

 

Полученный в исследованиях материал был обработан методами статистического анализа, используемыми в биологии и медицине и описанными в руководствах М.В.Славина (1989) и Г.Ф.Лакина (1990).

 

Для всех данных определялись среднее арифметическое значение (X), ошибка среднего арифметического (x). Оценка достоверности различий средних проводилась с использованием критерия Стьюдента [41].

 

Статистическая обработка материала производилась на PC Pentium-3, с использованием пакета статистических программ Excel 2000 приложения Microsoft office для среды. Результаты статистической обработки сведены в таблицы и использованы в рисунках.

 

Вверх               Содержание монографии

 

2.7. Использованные схемы лечения больных острым панкреатитом

 

2.7.1. Принципы общего лечения больных ОП

Диагноз ставился на основании жалоб, анамнеза, клинико-лабораторных данных, результатов осмотра и ультразвукового исследования гепато-панкреато-дуоденальной зоны и по показаниям диагностической лапароскопии.

 

У больных с различными формами панкреонекроза в течение первых суток придерживались активно-выжидательной тактики. Проводили интенсивную консервативную терапию с включением в комплекс лечебных мероприятий спазмолитиков, цитостатиков, анальгетиков, кровезаменителей дезинтоксикационного и гемодинамического ряда.

 

Показанием к операции в экстренном порядке являлся распространенный перитонит при неуточненном источнике (10 больных), в срочном – прогрессирующая интоксикация и полиорганная недостаточность, несмотря на проводимую комплексную консервативную терапию в течение 12-24 ч (12 больных) или отсутствие положительного эффекта от проводимой интенсивной терапии в течение 2-3 суток от начала терапии (6 больных). В сроки более 2 нед от начала заболевания показанием к операции служили «поздние» постнекротические септические осложнения панкреонекроза (1 больной).

 

Диагностическая лапароскопия была проведена у 43 больных. У 14 больных была выявлена отечная форма панкреатита, а у 29 – деструктивный панкреатит. Жировой панкреонекроз отмечен у 9 больных, гемморрагический – у 6, смешанная форма панкреонекроза – у 14. Видеолапароскопия проводилась с целью выбора дальнейшей тактики лечения.

Для 7 больных с жировой формой панкреонекроза опреативное вмешательство закончилось лапароскопическим дренированием сальниковой сумки и наложением разгрузочной холецистостомы, у 3 – выполнена лапароскопическая холецистэктомия с дренированием общего желчного протока.

 

У 19 больных после лапароскопии были произведены дренирующие операции, включающие лапаротомию, абдоминизацию поджелудочной железы, марсупилизацию с дренированием сальниковой сумки и наложением разгрузочного дренажа билиарного тракта.

Послеоперационное интенсивное лечение включало антибактериальную и инфузионную терапию (коллоидные и кристалоидные растворы, белковые препараты, растворы, корригирующие кислотно-щелочное состояние и электролитный баланс, гемотрансфузии), цитостатики, ингибиторы протеаз, антикоагулянты.

 

Из антибактериальных препаратов, в основном использовали аминогликозиды (гентамицин) в комбинации с пенициллинами (оксациллин, ампициллин) или линкозамидами (линкомицин) и метронидазолом. Препаратами резерва в этот период служили цефалоспорины 2-3 поколения. Длительность антибактериальной терапии составляла не менее 7 суток.

Из методов экстакорпоральной детоксикации применяли плазмаферез у 11 больных, гемосорбцию – у 4, ультрафиолетовое облучение крови – у 6.

 

На фоне традиционной терапии 19 больных с деструктивными формами панкреатита получали сандостатин. Препарат вводили внутривенно по 100-200 мкг 2 раза в день в первые сутки до операции, по 100 мкг внутривенно 2 раза в день больным с жировым панкреонекрозом и по 200 мкг – с геморрагическим и смешанным панкреонекрозом в течение 5-9 суток [211].

В одном случае у больной с тотальным панкреонекрозом, возникшем в послеродовом периоде, сформировался панкреатический свищ, который на фоне применения сандостатина закрылся к концу второй недели.

 

У 22 больных с отечной формой острого панкреатита препарат вводили внутривенно по 100 мкг 2 раза в сутки, в течение 3-х дней (без использования традиционной терапии) и в дозировке 50 мкг 2 раза в день подкожно на фоне традиционной терапии. При этом болевой синдром купировался к концу 1-х суток, а показатели амилазы приходили к норме к концу 3-х суток. Развитие деструктивной формы панкреатита отмечено в 1 случае.

 

2.7.2. Применение озонотерапии

Начиная с первых суток после поступления в стационар, 23 больным острым панкреатитом проводилась озонотерапия в течение 8 суток. Озонирование физиологического раствора осуществляли на установке фирмы «Медозон» УОТА-60-01. Озонированный физиологический раствор вводили один раз в сутки в объеме 400мл с концентрацией озона 4-7 мг/л. В этой группе при деструктивной форме (12 больных) сочетали общую озонотерапию с санацией брюшной полости ОФР.

 

У 15 больных в послеоперационном периоде с целью деконтоминации проводили ректальные инсуфляции газообразной озонокислородной смеси в количестве 50-500 мл с концентрацией озона 5-60 мкг/мл.

 

2.7.3. Применение глутоксима

На фоне традиционной терапии глутоксим получало 9 больных отечной формой панкреатита; препарат вводился внутримышечно ежедневно по 5-40 мг (50-300 мг на курс) в течении 5 дней.

В зависимости от применяемой схемы лечения все больные были разделены на группы, которые представлены в таблице 6.

 

Таблица 6

Разделение больных ОП в зависимости от метода терапии

 

1-я глава 3-й части           2 глава            3-4 главы 3-й части

Содержание монографии